دانلود پایان نامه

داخل محيط کشت به قطعات کوچک خرد گرديد و به مدت30 دقيقه در انکوباتور باقي ماند تا امکان خروج اسپرم ها از اپي ديديم فراهم آيد. لازم به ذکر است که براي جلوگيري از ايجاد شوک حرارتي و آسيب به اسپرم ها، تمام وسايل مورد استفاده و محيط کشت قبل از مصرف و شروع عمليات در انکوباتور 37 درجه قرار داده شدند.
2-8-2) شمارش اسپرمها :
5 ميکروليتر از مايع مني با 95 ميکروليتر محلول رقيق کننده(0.35% فرمالين، 5% بيکربنات سديم و 0.25% رنگ تريپان بلو ) رقيق گرديد. 10 ميکروليتر از سوسپانسيون حاصل بر لام نئوبار منتقل گرديد و تعداد اسپرمها در هر ميلي ليتر با استفاده از فرمولd ×????? n ×و توسط ميکروسکوپ نوري با درشت نمايي ??? برابر محاسبه گرديد؛ که n تعداد اسپرمهاي شمارش شده و d عکس رقت سوسپانسيون حاوي اسپرم ميباشد (Zambrano et al, 2005)
2-8-3) ارزيابي قابليت زنده ماندن اسپرم ها
براي ارزيابي درصد اسپرمهاي مرده، رنگآميزي ائوزين- نگروزين مورد استفاده قرار گرفت. بدين منظور 20 ميکروليتر از مخلوط ائوزين 0.05% و نگروزين به حجم برابري از سوسپانسيون اسپرم اضافه شد. مبناي تشخيص اسپرمهاي مرده در اين روش رنگآميزي بر اين اصل استوار است که در اثر آسيب به غشاء پلاسمايي، اسپرمها در برابر رنگ مذکور نفوذپذير ميگردند. لذا آن دسته از اسپرمهايي که هر يک از قطعات سر، گردن و يا دم آنها رنگ گرفته بود به عنوان اسپرمهاي مرده در نظر گرفته شدند. تعداد ??? اسپرم براي هر نمونه با درشتنمايي ??? برابر مورد بررسي قرار گرفت و نتايج حاصل در قالب درصد بيان شدند (Wyrobek et al., 1983).
2-8-4) بررسي تحرک اسپرماتوزوئيدها
براي اين منظور، ?? ميکروليتر از محلول رقيق شده اسپرم بر روي لام قرار داده شد. شمارش اسپرمهاي متحرک با حرکت هاي سريع(RPFM) ، آهسته (SPFM)، حرکت درجا (RM) و غير متحرک (ML) در چند ميدان ديد و در سه مرحله با استفاده از ميکروسکوپ نوري و بزرگنمايي 400 صورت گرفت و درصد اسپرمهاي متحرک بدست آمد (World Health Organization 2010)
2-8-5) بررسي وضعيت بلوغ هسته اسپرم: رنگ آميزي آنيلين بلو (AB)
پروتئين هيستون داراي تعداد زيادي اسيدآمينه ليزين ميباشد که با رنگهاي اسيدي مانند آنيلين بلو واکنش ميدهد و آبي رنگ ميشود. بنابراين اسپرمهايي که پس از تراکم در کروماتين خود، داراي هيستونهاي اضافي باشند با اين رنگ آميزي مشخص ميشوند. پس از تهيه اسمير از هر نمونه حيواني و خشک شدن در هوا، مرحله فيکس شدن نمونهها توسط فيکساتيو گلوتارآلدئيد ?% در بافر به مدت ?? دقيقه انجام شد. در مرحله بعد نمونهها توسط محلول ?% آنيلين بلو در اسيد استيک ?% (?/?=PH) به مدت ? دقيقه رنگ آميزي شدند. پس از شستشو با آب مقطر، لامها با ميکروسکوپ نوري و عدسي 100× مورد بررسي قرار داده و با شمارش ??? اسپرم، درصد اسپرم بيرنگ (نابالغ) تعيين گرديد. (Hamadeh et al., 2001)

2-8-6) بررسي DNA شکسته و يا تک رشته اي: رنگ آميزي آکريدين اورانژ (AO)
رنگ فلورسنت، جهت تمايز DNA دو رشته اي سالم از DNA تک رشته اي ناسالم و دناتوره بکار ميرود. AO با DNA دو رشته اي سالم زير ميکروسکوپ فلورسنت سبزرنگ و با DNA تک رشته اي دناتوره زرد تا قرمز رنگ مي شود( 11 Varghese et al.,20). پس از تهيه اسمير از هر نمونه و خشک کردن در هوا، فيکس شدن نمونه ها توسط محلول کارنوي(متانول: اسيد استيک:1:3 ) به مدت حداقل 2ساعت صورت گرفت و سپس رنگ AO تازه با غلظت 19/0 ميلي گرم در بافر سيترات فسفات به مدت 10 دقيقه براي رنگ آميزي لام ها بکار رفت. پس از شستشو توسط آب مقطر، لام ها توسط ميکروسکوپ فلورسنت و در يک محيط تاريک با فيلتر nm 460 بررسي شدند. براي هر پروتکل 400 اسپرم مورد بررسي قرار گرفت. ( 08 Rezvanfar et al, 20).

2-9) سنجش فاکتورهاي بيوشيميايي
2-9-1) روش اندازه گيري مالون دي آلدئيد :
براي اين منظور يک گرم از بافت بيضه در بافر فسفات صفر درجه سانتيگراد 0.05 مولار با 7.4=ph و با غلطت 10 درصد (w/v) هموژنيژه گرديد و سپس محلولهاي حاصل با دور g 1000 سانتريفيوژ گرديد. مايع رويي جهت ميزان توليد محصولات پراکسيداسيون ليپيد مورد استفاده قرار گرفت. درجه پراکسيداسيون ليپيدها بر مبناي ميزان تشکيل مالون دي آلدئيد (MDA) تعيين ميگردد. مالون دي آلدئيد محصول نهايي پراکسيداسيون اسيدهاي چرب است و با تيوباربيتوييک اسيد (TBA)وارد واکنش شده و کمپلکس رنگي ايجاد ميکند. اساس روش اندازه گيري اسپکتروفتومتريک رنگ ايجاد شده بر اثر واکنش TBA با MDA ميباشد. بدين منظور300 ميکروليتر تري کلريک اسيد 10 درصد به 150 ميکروليتراز محلول رويي نمونه سانتريفيوژ شده اضافه شده و به مدت 10 دقيقه با دور g 1000 در دماي 4 درجه سانتيگراد سانتريفوژگرديد. 300 ميکروليتر از محلول رويي به لوله آزمايش منتقل و با 300 ميکروليتر از تيوباربيتوريک اسيد0.67% در دماي 100 درجه سانتيگراد براي 25 دقيقه انکوبه شد.5 دقيقه بعد از خنک شدن محلول ، رنگ صورتي ناشي از واکنش TBA-MDA ظاهر و به کمک اسپکتروفتومتر در طول موج 535 نانومتر ارزيابي گرديد. غلظت MDA بصورت nmol/g wet tissue بيان شد(Hosseinzade et al., 2005).

2-9-2) روش اندازه گيري قدرت آنتي اکسيداني کل(FRAP):
قدرت آنتي اکسيداني کل بافت بيضه با اندازه گيري قدرت احياء كنندگي/ آنتي اكسيداني فريك (FRAP:Ferric Antioxidant Power) محاسبه گرديد. در روز آناليز بافت ها در محلول KCL سرد (5/1%) براي گرفتن 10% سوسپانسيون هموژني، هموژنيزه شده و براي ارزيابي بيوشيميايي استفاده شدند.
ارزيابي FRAP تغيير در جذب 593 نانومتر را بواسطه تشکيل ترکيب Fen- Tripyridyltriazine آبي رنگ از Fem اکسيد شده بي رنگ توسط عمل آنتي اکسيدانت هاي دهنده الکترون را ا
ندازه ميگيرد (Iris& Strain, 1996).
معرف FRAP شامل :
محلول1: شامل بافر استات 300 ميلي مولار (g3/1 سديم استات +ml16 اسيد استيک در يک ليتر آب مقطر6/3PH: )
محلول2: TPTZ 10 ميلي مولار در HCL 40 ميلي مولار
محلول3: Fecl3.6H2O 20 ميلي مولار در آب مقطر که اين 3 محلول تهيه شده به نسبت 1:1:10 با هم مخلوط گرديدند. محلول معرف شامل ml25 محلول 1، ml2.5 محلول 2 و ml5/2 محلول 3 مي باشد. محلول معرف بايد هميشه به تازگي تهيه شود. 50 ميکروليتر محلول هموژنيزه بافت به 5/1 ميلي ليتر محلول تازه آماده شده و از قبل گرم شده(37 درجه سانتي گراد) معرف FRAP در لوله آزمايش اضافه و سپس در 37 درجه ساتي گراد براي 10 دقيقه انکوبه گرديد. جذب کمپلکس آبي رنگ عليه محلول بلانک در 593 نانومتر خوانده ميشود. واکنش براي 5 دقيقه بررسي ميشود. معرف بلانک شامل5/1 ميلي ليتر معرف FRAP + 50 ميکروليتر آب مقطر مي باشد. محلول استاندارد Fen در رنج 100 به 1000 ميلي مول از فروس سولفات Feso4-7H2O در آب مقطر آماده مي شود. داده ها بر اساس ميلي مول يون فريک کاهش يافته به فرم فروس در ليتر بيان مي شود (Iris& Strain, 1996; Hosseinzade et al, 2005).
2-9-3) روش اندازه گيري فعاليت آنزيم کاتالاز:
فعاليت كاتالاز بر اساس توانايي آن در تجزيه H2O2 در بافت هموژنيزه شده بيضه تعيين گرديد. تجزيهH2O2 با کاهش جذب در طيف جذبي 240 نانومتر قابل بررسي مي باشد. تفاوت در جذب در واحد زمان معادل مقدار فعاليت کاتالاز است. براي اين منظور از پراکسيد هيدروژن 30 ميلي مولار به عنوان سوبسترا و از بافر فسفات 50 ميلي مولار با 7.4=PH به عنوان جايگزين سوبسترا در محلول بلانک استفاده شد. محلول سنجش محتوي 2 ميلي ليتر محلول هموژناي بافتي و 1 ميلي ليتر محلول پراکسيد هيدروژن ميباشد. واکنش با افزودن H2O2 شروع شد وکاهش در جذب به کمک اسپکتروفتومتر در طول موج 240 نانومتر به مدت 30 ثانيه بررسي و در پايان مقادير بر حسب U/g tissue بيان گرديد(Havir &Mellate, 1987).
2-10) اندازه گيري تستوسترون سرمي
براي اندازه گيري غلظت تستوسترون سرمي از روش الايزا استفاده گرديد. اين کار با کمک دستگاه الايزا ريدر Staff fax 3200 ساخت کمپاني آمريکا Avernes و کيت شرکت مونوباين انجام گرديد.
2-11) مطالعات هيستوشيميايي بيضه
2-11-1) رنگ آميزي آهن وايگرت
به منظور مطالعه بافت بيضه، روش رنگ آميزي آهن وايگرت مورد استفاده قرار گرفت. در اين روش رشته هاي کلاژن به رنگ قرمز، عضلات و پوشش هاي شاخي به رنگ زرد و هسته ها به رنگ آبي تا سياه قابل مشاهده هستند.
2-11) آناليز و تحليل داده ها
محاسبه آماري با استفاده از نرم افزار آماري SPSS نسخه 19 و با استفاده از روش آناليز One-way ANOVA به طرقDuncan و Tukey انجام گرفت. (p0.05) به عنوان معيار معني دار بودن اختلاف ها در نظر گرفته شد.

علائم اختصاري بکار برده شده در نمودارهاي مربوط به گروه هاي تحت تيمار
CO: گروه کنترل
RJ: گروه دريافت کننده ژل رويال
BL: گروه دريافت کننده داروي بلئومايسين
RJ+BL: گروه ترکيبي(بلئومايسين + ژل رويال)
*: اختلاف معني دار با گروه کنترل (p0.05)
#: اختلاف معني دار با گروه داروي بلئومايسين(p0.05)

3-1) نتايج حاصل از ارزيابي خصوصيات اسپرم

3-1-1) نتايج حاصل از بررسي تعداد اسپرم
همانگونه که در نمودار 3-1 مشاهده ميشود تجويز داروي بلئومايسين در موشهاي صحرايي نر کاهش معني داري (p0.05) را در تعداد اسپرم نسبت به گروه کنترل و ژل رويال نشان داده است. تيمار همزمان ژل رويال و بلئومايسين باعث افزايش معني دار تعداد اسپرم در سطح p0.05 گرديد، به طوري که در پايان دوره تيمار تعداد اسپرم ها در اين گروه(BL+RJ) از نظر آماري هيچ تفاوت معني داري (p0.05 ) با گروه کنترل رويال نداشت. همانگونه که در نمودار مشهود است از نظر آماري هيچ اختلاف معني داري ميان گروه کنترل و گروه دريافت کننده ژل رويال وجود ندارد. (نمودار3-1 و جدول 3-2).

نمودار 3-1: مقايسه ميانگين تعداد اسپرم ها در گروه هاي تحت تيمار(* اختلاف معني دار با گروه کنترل و گروه ژل رويال ( p0.05)؛ # اختلاف معني دار با گروه داروي بلئومايسين(p0.05))

3-1-2) نتايج حاصل از مطالعه ميزان اسپرم زنده
نمودار3-2 نشان مي دهد که درصد اسپرم هاي زنده در گروه تيمار شده با داروي بلئومايسين به طور معني داري نسبت به گروه کنترل ( p0.05) کاهش يافته است. تجويز ژل رويال توأم با داروي بلئومايسين به صورت معني دار (p0.05) نسبت به گروهي که تنها بلئومايسين را دريافت نموده بودند، در افزايش قدرت زيست اسپرم ها موثر واقع شد(جدول2-3 ). هيچ تفاوت معني داري ميان گروه کنترل و گروه دريافت کننده ژل رويال مشاهده نشد (تصوير3-1). لازم به ذکر است که به منظور ارزيابي ميزان اسپرم هاي مرده رنگ آميزي ائورين- نگروزين مورد استفاده قرار گرفت

تصوير 3-1: اسپرم زنده(1) با سر بدون رنگ و اسپرم مرده با سر صورتي(2)، رنگ آميزي ائورين(E&N ×400).

نمودار3-2 درصد اسپرم هاي زنده در گروه هاي تحت تيمار(* اختلاف معني دار با گروه کنترل و گروه ژل رويال ( p0.05)، # اختلاف معني دار با گروه داروي بلئومايسين(p0.05))

3-1-3)نتايج حاصل از مطالعه ميزان تحرک اسپرم
بررسي هاي صورت گرفته در گروه هاي مختلف آزمايشي نشان داد که ميزان تحرک سريع اسپرم ها(RPFM) در گروه تحت درمان با داروي بلئومايسين کاهش معني داري (p0.05) نسبت به گروه کنترل و ژل رويال داشت در حالي که اسپرم هاي بدون حرکت(ML) و اسپرم ها با حرکات آهسته (SPFM) در اين گروه نسبت به گروه کنت
رل افزايش معني داري يافته بود.هيچ تفاوت معني داري (p0.05) ميان گروه کنترل و گروه دريافت کننده ژل رويال مشاهده نشد. تيمار با ژل رويال متعاقب تجويز داروي بلئومايسين در مقايسه با گروهي که تنها داروي بلئومايسين را دريافت کرده بودند حرکت سريع اسپرم (RPFM) را به طور معني دار (p0.05) نسبت به گروه داروي بلئومايسين، بهبود (افزايش) و حرکت آهسته (SPFM) را به طور معني دار (p0.05) نسبت به گروه بلئومايسين کاهش بخشيد.
درصد اسپرم هاي بدون حرکت در گروهي که همزمان با داروي بلئومايسين ، ژل رويال را نيز دريافت نموده (BL+RJ) با گروه کنترل تفاوت معني دار (p0.05) نشان داد. تفاوت چنداني در ميزان اسپرم ها با حرکات درجا (RM) ما بين گروه هاي مختلف آزمايشي مشاهده نشد(جدول3-1، نمودار3-3 ).

درصد اسپرم با حرکت سريع
درصد اسپرم با حرکت آهسته
درصد اسپرم با حرکت درجا
درصد اسپرم بدون حرکت

63.50±1.18
17.53±0.67
11.23±0/60
7.73±.37
کنترل
62.43±1.15
16.83±0.33
11.13±0.58
10.60±0.30
ژل رويال
51.63±0.50*
23.86±0.66*
12.03±0.52
12.46±0.73*
بلئومايسين
59.80±2.36
16.13±2.03
12.50±1.50
11.56±0.58
بلئومايسين+ ژل رويال

جدول3-1: درصد انواع تحرک اسپرم ها در گروه هاي تحت تيمار(* اختلاف معني دار با گروه کنترل ( p0.05)(

نمودار3-3: درصد تحرک اسپرم ها در گروه هاي تحت تيمار(* اختلاف معني دار با گروه کنترل ( p0.05)، # اختلاف معني دار با گروه داروي بلئومايسين(p0.05))
3-1-4) نتايج بررسي وضعيت بلوغ هسته اسپرم
اين مطالعه نشان داد درصد اسپرم هاي نابالغ در گروه تحت درمان با داروي بلئومايسين، داراي اختلاف معني داري در سطح p0.05 با گروه کنترل و گروه دريافت کننده ژل رويال مي باشد. با مصرف همزمان ژل رويال به عنوان آنتي اکسيدان با داروي بلئومايسين در گروه ترکيبي(BL+RJ) درصد اسپرم هاي نابالغ نسبت به گروهي که بلئومايسين را به تنهايي دريافت نموده بودند(BL)، کاهش يافت. اما با اين وجود درصد اسپرم هاي نابالغ در اين گروه (BL+RJ) از نظر آماري اختلاف معني داري را در سطح p0.05 نسبت به گروه ژل رويال و کنترل نشان داد(نمودار3-4، جدول2-3).

شکل3-2: اسپرم بالغ با سر روشن رنگ نگرفته (شماره1)، اسپرم بالغ با سر تيره(شماره 2)؛ رنگ آميزي آنيلين بلو (×400).

نمودار 3-4: نتايج حاصل از شمارش اسپرم هاي نابالغ(* اختلاف معني دار با گروه کنترل و ژل رويال ( p0.05)، # اختلاف معني دار با گروه داروي بلئومايسين(p0.05))
3-1-5) نتايج حاصل از مطالعه DNA اسپرم
نتايج حاصل از رنگ آميزي آکريدين اورانژ اسپرم در گروه تحت درمان با داروي بلئومايسين نشان داد که درصد اسپرم ها با DNA آسيب ديده در اين گروه ، به طور معني داري در سطح p0.05 نسبت به گروه کنترل و گروه ژل رويال افزايش يافته است. با مصرف همزمان ژل رويال با داروي بلئومايسين در گروه ترکيبي(BL+RJ) درصد آسيب نسبت به


دیدگاهتان را بنویسید